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IVPT测试中的皮肤研究

在IVPT测试中,我们经常需要用到真正的皮肤作为我们的实验材料去研究药物在皮肤上的渗透性。因此,理解皮肤的特点,了解皮肤的制备以及评估皮肤的完整性对于IVPT研究非常重要。今天,锐拓的小编在此 分享一下锐拓对于IVPT测试中对皮肤研究的一些相关知识,希望对各位研究扩散实验的老师有所启发。

皮肤的特点:

皮肤是人体的天然屏障和净化器,一方面,皮肤对机体具有各个方面的保护作用;但皮肤不是绝对严密而无通透性的屏障(图1),皮肤还具有一定的渗透能力和吸收作用。

图1 人的皮肤构造

一般来说,水分和水溶性成分不能从皮肤吸收;而油及油溶性成分,可经皮肤吸收。供皮肤表皮处利用的,如收敛,杀菌,漂白等,以采用水溶性药剂为适宜;而一些营养成分和在体内起作用的药物,以油溶性药剂为好。

外界物质对皮肤的渗透是皮肤吸收小分子物质的主要渠道,物质可能进入皮肤的途径通常有以下几种:

1、软化角质层,经角质层细胞膜渗透进入角质层细胞,继而可能再透过表皮进入真皮层;、

2、少量大分子和不易透过的水溶性物质,可以通过皮肤毛囊,经皮脂腺和毛囊管壁进入皮肤深层真皮内,再由真皮向四处扩散;

3、某些超细的分子物质经过角质层细胞间隙渗透进入真皮。

入皮肤的物质有三种可能的结果:

1、完全被吸收,进入皮肤的微循环。

2、与角质层或皮下脂肪结合,形成所谓存储器,以后慢慢地释放,进入微血管

3、被皮肤内各种酶进行新陈代谢。

角质层是影响皮肤渗透吸收最重要的部位,软化的皮肤可以增加渗透吸收。皮肤表皮角质层可以吸收较多的水分,特别在皮肤被水浸润后,或采用包敷的方法,可以使皮肤水分增加,提高皮肤的吸收作用;动物脂肪,酸类化合物,激素等,比较容易被皮肤吸收;植物油较动物油难被吸收;矿物油,水和固体物质不易被吸收;粉体,水溶液和悬浮体系的吸收一般较差;软膏可以浸软皮肤,阻止水分挥发,因而能够增大吸收;有机溶剂由于对皮肤渗透性强,也可以增加吸收;气体则可以进入皮肤内部;有些物质浓度高时反而吸收减少,如酸类物质浓度大时,会和皮肤蛋白结合形成薄膜,阻止皮肤吸收。 

皮肤的制备

近十几年来常用于经皮渗透研究的动物可分为两大类,即无毛动物和有毛动物,无毛动物主要有无毛小鼠、无毛大鼠、蛇等,有毛动物有小鼠、大鼠、豚鼠、猪、兔等。有毛动物与无毛动物的皮肤,在结构上的差异主要是皮肤附属器的不同。药物可以通过皮肤附属器吸收,而且吸收速度也较快,但吸收面积只占整个皮肤的0.1%~1%,所以不是主要经皮吸收的主要途径。不同动物皮肤渗透性不同,研究表明:猪、猴的皮肤渗透性与人皮肤相近,家兔、大鼠、豚鼠的皮肤渗透性比人皮肤大,选择动物模型时应注意。

猪皮肤对药物的渗透性较接近人体皮肤(详见表1),且2~3月龄的小猪皮肤解剖生理特点最接近于人,选择小猪皮肤作为透皮吸收研究模型较理想。取皮部位常用猪背部和猪耳。

表1 人与3月龄小猪皮肤各结构厚度的比较

在做体外透皮吸收试验时,提供猪的种系、性别、年龄和体重以及用作渗透研究的体表部位等相关资料十分重要。

一、透皮试验研究动物的选择

阅读国内体外透皮研究相关文献,发现在实验动物的选择、离体皮肤的制备、皮肤的储存方法等方面不尽相同。

实验动物的选择:

1、种系 包括巴马小香猪、普通仔猪

2、性别 雌雄均有

3、月龄 普通仔猪一般选择10-15日龄或20-30日龄,巴马小香猪一般选择1月龄或2-3月龄

4、体重 包括8-15kg或35-40kg不等

5、取皮部位 包括背部、腹底部、腹侧部、耳部,常用背部、腹部皮肤,少用耳部(见表2)

表2 30~35日龄健康仔猪不同部位皮肤厚度比较

二、离体皮肤的制备

选取2~3月龄巴马香猪,清洗全身皮肤,用手术刀或电动脱毛器小心剃去背部和耳部皮肤的被毛(不得有划痕),24h后,切断前肢动脉使其缺血致死,剥离皮肤,把皮肤平铺在干净的玻璃板上,让角质层向下,用小刀片或其它钝器沾生理盐水剔除皮下脂肪、组织和毛细血管,然后用生理盐水反复冲洗干净、擦干、用铝箔纸包裹置于保险盒中,-22℃冰箱保存备用(不超过1个月)(如下图2)。实验前隔日取出融冻(0~5℃),使用前用生理盐水反复淋洗至澄清。

注意:实验前巴马香猪皮肤不得有任何损伤。

图2 皮肤的制备

皮肤完整性测试

皮肤的完整性对于体外皮肤渗透性研究的结果有较大的影响,同时也会产生数据的变异性。各国的法规对于皮肤的完整性研究是由相关规定的。

表3 各国法规对于皮肤完整性的规定

皮肤完整性测试试验,除了目视检查外,建议在每个实验中至少还需要进行以下完整性测试的一种或者两种,再将皮肤安装在 Franz 扩散池上。根据文献报道常用的皮肤完整性测试方法有如下几种:

(1)TWP(Tritiated Water Method)氚水方法

(2)Transepidermal Electrical Resistance Method(TEER)经皮电阻方法

(3)Transepidermal Water Loss Method(TEWL)经皮失水方法

氚水方法:为了确定氚化标记水的吸收特性,将受体隔室充满生理盐水。将无限剂量的氚代物施加到皮肤表面。在不同的时间点(0.5、1、2、3、4 和 5 小时)收集受体溶液,并测定氚代物,计算渗透常数 (Kp),通过渗透常数判断皮肤的完整性。

经皮电阻方法:皮肤的电阻抗性,用电阻值KΩ表示,采用惠斯登电桥记录皮肤对离子的通透性,这是一种简单稳定的评价皮肤屏障功能的方法。比如试验用皮肤来自于经安乐处死的28日到30日龄的大鼠,根据皮肤角质层缺失的程度以及皮肤屏障功能的减少(TER低于阈值)的情况来鉴定皮肤是否破损。

经皮失水方法:经皮失水又称为透皮失水,表明真皮深层的水分通过表皮的蒸发散失,是描述皮肤完整性的重要参数,其与皮肤角质层含水量密切相关,TEWL值越高,表明皮肤散失水分越多,角质层的屏障功能越差。经表皮失水 (TEWL) 被广泛用于评估皮肤的屏障功能。TEWL 定义为单位时间内通过角质层扩散到每个皮肤表面的水蒸气量,用g·m-2·h-1表示。

 

下面,我们着重介绍TEER经皮电阻方法

1. 仪器与试药

液相色谱仪一台;RT8 Franz扩散池一台,离体皮肤电阻测试仪。

2. 测试方法

皮肤模型电阻抗测试仪的操作过程

将待测试用的实验皮肤切片(实验用离体皮肤,3D重组表皮模型等)夹在两个腔体之间,每个腔体中注入0.9%的NaCl溶液,并在每个腔体中插入氯化银电极,测量电极之间的电阻抗。评价方法因使用的细胞而异,作为经皮吸收实验的准备,根据电阻抗测定结果对使用的皮肤膜进行特性评价和筛选。此外,屏障功能降低的角质层细胞往往具有较低的阻抗,从水和角质层的电阻抗来评价生物皮肤屏障功能。


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